近日，南京農業(yè)大學園藝學院汪良駒教授團隊研究論文《Transcription factor MdNAC33 is involved in ALA-induced anthocyanin accumulation in apples》在國JIZHU名期刊《Plant Science》上在線發(fā)表。該研究探討了NAC轉錄因子參與ALA誘導蘋果花青苷積累的分子機制，為ALA在GAO品質蘋果生產(chǎn)上推廣應用提供了新的理論依據(jù)。

研究背景

5-氨基乙酰丙酸（ALA）是一種新型天RAN植物生長調節(jié)物質，能夠促進多種果實花青苷積累。然而，其潛在的機制仍然不清楚。在先前的一項轉錄組研究中，我們發(fā)現(xiàn)多個轉錄因子（TFs）在ALA誘導蘋果花青苷積累過程中具有重要作用。在本研究中，我們專門探究了蘋果NAC轉錄因子MdNAC33與ALA誘導的蘋果花青苷積累的關系，并且運用多種分子生物學手段，解析了MdNAC33調控ALA誘導花青苷積累的分子機制。

研究內容

1.ALA正向調控蘋果MdNAC33的表達

蘋果果實在光照下果皮花青苷含量不斷上升，其間MdNAC33表達量上升；若用外源ALA處理，則果皮花青苷積累更多，同時，MdNAC33表達量也上升更多，說明MdNAC33與ALA促進的花青苷積累存在正相關關系。我們克隆MdNAC33上游2000bp啟動子序列，并連接到GUS報告基因上游，瞬時轉化蘋果葉片，并用ALA處理。結果發(fā)現(xiàn)，ALA處理顯著提高MdNAC33啟動子的轉錄活性，說明MdNAC33可能參與ALA誘導的蘋果花青苷積累。

2.MdNAC33參與ALA誘導的花青苷的積累

為了明確MdNAC33在ALA誘導的蘋果花青苷積累中的作用，我們構建MdNAC33超表達與RNAi干擾表達載體，并通過農桿菌轉化法瞬時轉化至蘋果果皮或葉片，或者穩(wěn)定轉化至‘王林’蘋果愈傷組織。結果發(fā)現(xiàn)，無論是哪個體系，超表達(OE-)MdNAC33均能顯著提高蘋果中花青苷含量，同時ALA具有增效效應；而干擾(RNAi-)MdNAC33表達后，則蘋果花青苷含量顯著降低，且ALA能緩解這種抑制效應。此外，RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，MdbHLH3、MdDFR和MdANS在轉基因蘋果中的表達量發(fā)生明顯變化，暗示著這些基因可能作為MdNAC33下游靶基因，共同參與蘋果花青苷合成調控。

圖2. MdNAC33參與ALA誘導蘋果花青苷的生物合成的功能分析

3.MdNAC33與MdbHLH3、MdDFR和MdANS的啟動子結合并激活其轉錄

由于MdbHLH3、MdDFR和MdANS在轉基因蘋果中的相對表達量出現(xiàn)明顯變化，猜想，MdNAC33可能通過激活這些基因的表達來調節(jié)花青苷積累。于是，我們克隆了這些基因上游2000bp的啟動子區(qū)。通過酵母單雜（Y1H）發(fā)現(xiàn)，MdNAC33可以與MdbHLH3、MdDFR和MdANS啟動子結合。EMSA實驗也證明了這種結合。同時，我們開展雙熒光素酶及GUS報告基因實驗，證明MdNAC33可以激活MdbHLH3、MdDFR和MdANS的啟動子。其中，MdNAC33轉錄激活的MdbHLH3可以促進MdDFR和MdUFGT轉錄，而MdNAC33轉錄激活的MdDFR和MdANS也促進花青苷合成。

圖3. Y1H及EMSA證明MdNAC33與花青苷合成和調控相關基因啟動子結合

4.MdNAC33與MdMYB1互作，促進花青苷合成與積累

已知MBW (MdMYB1、MdbHLH3、MdbHLH33、MdTTG1)蛋白復合物在蘋果花青苷合成調節(jié)中發(fā)揮重要作用。為了檢驗MdNAC33與這些傳統(tǒng)轉錄因子的關系，我們進行Y2H、LCI和BiFC實驗。結果表明，MdNAC33與MdMYB1互作，并通過后者來上調MdUFGT和MdGSTF12表達，從而促進花青苷合成與積累。

圖4. MdNAC33與MdMYB1的互作分析

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)MdNAC33在ALA誘導蘋果花青苷積累中起到關鍵作用?；诖?，我們提出MdNAC33參與ALA誘導蘋果花青苷積累的模型。首先，ALA處理上調MdNAC33表達。然后，MdNAC33通過三種方式來促進花青苷合成與積累。一，直接激活MdDFR和MdANS表達；二，直接激活調節(jié)基因如MdbHLH3，進而上調結構基因如MdDFR和MdUFGT表達；三，與轉錄因子MdMYB1互作，增強MdMYB1與靶基因結合，促進MdUFGT和MdGSTF12表達，最終，使得ALA處理后的蘋果花青苷積累顯著增加。本研究結果為ALA調控蘋果花青苷積累提供了新的理論證據(jù)。

作者簡介：

論文DI一作者為南京農業(yè)大學果樹學博士生張留孜，通訊作者為汪良駒教授、仲巖副教授?？蒲兄韽埥ㄦ谩⒋T士畢業(yè)生魏波、碩士研究生李亞格和方項博士在試驗研究以及論文撰寫過程中也發(fā)揮了重要作用。

汪良駒教授是江蘇省植物生理學會植物生長物質與生長調控ZHUAN業(yè)委員會主任。他于2000年起開始從事ALA在農林作物抗逆增產(chǎn)提質效應及其生物學基礎研究。其研發(fā)的產(chǎn)品“金村秋”、“禾稼春”和“秀果美”等已經(jīng)大面積應用于QUAN國20多個省市區(qū)農業(yè)生產(chǎn)區(qū)。其團隊先后獲得20多項政府專項資金資助，在國內外學術期刊發(fā)表與ALA有關研究論文100余篇，GUO家授權專利20余項，處于5-A農業(yè)領域研究前沿。

資助基金：

江蘇省農業(yè)自主創(chuàng)新資金重大項目——CX(20)2023

國JIA自然科學基金——32172512，31772253

江蘇省碳達峰碳中和前沿基礎項目——BK20220005

江蘇省高校優(yōu)勢學科項目

閱讀文章：https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2023.111949